諾貝爾在他生命的最後幾年，曾先後立下過3份內容非常相似的遺囑。第一份立於1889年，第二份立於1893年，第3份則立於1895年，並存放在斯德哥爾摩一家銀行，這也就是最終的遺囑。
諾貝爾在遺囑中，把大約100萬瑞典克朗贈與十多名親友，餘下部分（約3100萬瑞典克朗）用於設立諾貝爾獎。遺囑中關於設置諾貝爾獎的指示如下：
我，簽名人阿爾弗雷德·伯納德·諾貝爾，經過鄭重的考慮後特此宣布，下文是關於處理我死後所留下的財產的遺囑：
在此我要求遺囑執行人以如下方式處置我可以兌現的剩餘財產：將上述財產兌換成現金，然後進行安全可靠的投資，以這份資金成立一個基金會，將基金所產生的利息每年獎給在前一年中為人類做出傑出貢獻的人。將此利息劃分為五等份，分配如下：
一份獎給在物理界有最重大的發現或發明的人；
一份獎給在化學上有最重大的發現或改進的人；
一份獎給在醫學和生理學界有最重大的發現的人；
一份獎給在文學界創作出具有理想傾向的最佳作品的人；
最後一份獎給為促進民族團結友好、取消或裁減常備軍隊以及為和平會議的組織和宣傳盡到最大努力或做出最大貢獻的人。
物理獎和化學獎由斯德哥爾摩瑞典科學院頒發；醫學和生理學獎由斯德哥爾摩卡羅琳醫學院頒發；文學獎由瑞典文學院頒發；和平獎由挪威議會選舉產生的5人委員會頒發。
對於獲獎候選人的國籍不予任何考慮，也就是說，不管他或她是不是斯堪的納維亞人，誰最符合條件，誰就應該獲得獎金。我在此聲明，這樣授予獎金是我的迫切願望
這是我唯一有效的遺囑。在我死後，若發現以前任何有關財產處置的遺囑，一概作廢。
1892年1月2日，瑞典一家報紙公布了諾貝爾遺囑的主要內容，立即引起了國內外的極大轟動。雖然人們認為這份遺囑是促進人類進步的高尚行為，但攻擊它的聲音仍然不絕於耳，並且持續了整整一年多。