元和二年（1616）4月，德川家康死，他在死前消滅了豐臣遺族一家。8月，幕府對各諸侯頒發了所謂“元和二年禁教令”，要全國上下直到農民，鏟除教會、嚴禁信教，除明船外，信教的外國商船一律隻限在平戶、長崎兩地經商。荷英兩國人則不準在內地經商、居住。這一命令把禁教和統製外貿結合起來，已經顯露了鎖國的開始。幕府所以在這時加強禁教，無非為防止家康死後可能發生的內亂，以“耶穌為夷狄之邪法”作借口，威脅各地諸侯徹底歸順“神國”日本的將軍秀忠。幕府這一禁令，使禁教進入一新階段，對教會的迫害擴大到一般教徒身上。規定窩藏教士的人，火刑處死，沒收家產。由五人組作連環保。於是九州地方不少教徒乃至暗中支持他們的人陸續被捕殺。1620年，一艘從馬尼拉回日本的朱印船被英荷商船隊在台灣海峽捕獲，報告了幕府，船上載有兩名西班牙籍教士，連同船長日人平山被百般拷問，兩年後（1622）在長崎受火刑，船員12名被斬首。事後不到一個月，幕府又在長崎集體屠殺外國教士。日本教徒及被牽連的朝鮮人、中國人55人，世稱“大殉教”。[105]
各地諸侯為保全身份地位，都對教徒進行迫害。估計從元和五年（1619）到寬永十二年（1635），被處刑的日本教徒為數約達28萬人。刑罰極其殘忍，結果大部教徒被迫改宗。但仍有一部分堅持信仰，參加稱為“組”、“講”及“眾會”等秘密的信教組織。這些教徒被捕處刑時，還迷信“抵抗而被殺就不算殉教”的教條，毫不抵抗地死去。由此幕府更加感到天主教的危險，寬永五年（1628）起，越發加強禁教，甚至實施“踏繪”[106]的辦法。但迫害愈厲害，反抗力量也愈大，不久就在長崎地區爆發了大規模的島原起義。