1865年12月，利文斯敦又開始了第三次，也是他生命的最後一次非洲旅行。
這一次旅行的目的，當然也是為了替非洲內陸的人尋找一條能夠通往海岸的安全路線。而且在此次旅行中，利文斯敦也想探尋尼羅河的源頭。
被認為孕育了埃及文明的尼羅河源頭究竟在哪裏呢？自古以來這是大家都希望得到答案的問題，所以之前也有許多探險家前往探究。1864年一位叫貝卡的探險家終於由維多利亞湖行經阿爾巴湖途中發現了尼羅河的源頭，但當時的學術界並沒有正式予以承認。
現在，利文斯敦在羅福馬河的河口登陸，開始探險旅程，他雇用了40名身體強壯的印度人，包括忠心的蘇西和朱馬，這兩個人一直隨著他直到旅行結束為止。
利文斯敦再次沉湎於非洲旅行的樂趣。
“在空闊荒野沒有人探查過的地方旅行真是樂趣無窮……我的眼睛清明，步履堅定，即使一整天都勞累，到了晚上也會覺得是一種享受。”
他看到尼亞薩湖就像看到老朋友一樣。“又在那甜美的水中沐浴，聽湖水波濤聲，真是太愉快了！”他在沿途也遇到許多的奴隸隊，還到處看到了燒毀村落、殺人等奴隸販子的行徑。
不過，隨行的這些印度人特別懶惰，從不喂食利文斯敦帶來的駱駝、水牛，終於，它們由於體力不支，都餓死了。利文斯敦實在無法忍受，最後隻好把他們統統趕走。
因為如此，印度人便懷恨在心，散播不實的謠言：
“利文斯敦受到非洲人的襲擊，被殺死了，我們是拚了命好不容易才逃出來的。”
這個消息震驚了整個英國。利文斯敦的一位朋友愛德華·楊格自動組織了一個搜索隊去找尋利文斯敦的下落。
楊格沿希拉河到達了尼亞薩湖附近，才聽說利文斯敦並沒有遇害，正好端端地繼續從事探險工作，因而他才放心地回國去了。