第一次航行的順利完成令費迪南國王和伊莎貝拉女王十分滿意，他們順理成章地委派哥倫布開始著手第二次航海。這次的航海籌備工作進行得十分順利，這次的船隻，一共動員到 17艘，其中大型帆船就有 3艘。而這次出航的人員也不再是清一色的平鬆家族的人，除了第一次隨哥倫布出航的一些船員外，還包括摩爾戰爭結束後閑下來的貴族和為建設殖民地而派去的農民、開礦工和木匠等，總人數達 1500多人。
這一次，大家都對哥倫布心悅誠服。
這一次，哥倫布打算把住在法國的巴托洛梅和一直留在熱那亞的弟弟迭戈兩人也一起帶去。有這兩位弟弟同行，他會覺得比較安心，因為自己的親兄弟不會像平鬆那樣背叛他。
接到哥倫布的來信之後，迭戈日夜兼程地從熱那亞趕來，多年不見的兩兄弟都因這次的重逢而分外驚喜，他們互相擁抱在一起，傾訴多年來各自的經曆。
可是距離起航的時間已經不遠了，哥倫布的二弟巴托洛梅卻一直沒有到。“難道是沒有收到我的信？”哥倫布心急如焚。
這一次的航海照計劃是要從加第斯港出發。1493年 9月 25日，由 17艘帆船組成的大船隊揚起了西班牙國旗，浩浩****地離開了港口。旗艦仍叫做“聖瑪利亞”號，船隊還包括忠誠可靠的“尼娜”號。
“巴托洛梅沒有趕上，實在太可惜了!”事已至此，哥倫布也隻好死心了。
這時候，巴托洛梅正從法國快馬加鞭地趕來。當他趕到西班牙時，哥倫布的船隊已在前一天出航了。巴托洛梅望海興歎，不過，他不肯就此作罷，決心要設法挽回這失去的機會。
這一次出航，西班牙國王特意頒布聖諭，把讓印第安人皈依基督教的任務列在首位，同時要求對待印第安人要仁慈寬厚，如果西班牙人對印第安人有任何不公正之處，都應受到海上將軍哥倫布的嚴厲懲處。