1923年秋，陳鶴琴在自己住宅的客廳裏，開辦了南京鼓樓幼稚園，自己親任園長，聘請了2位教師，招收了12名流浪兒，開始開展兒童教育實驗。
他讓自己的女兒當小先生，教流浪兒識字、唱歌；他還和孩子們一起玩識字遊戲；甚至還和孩子們一起表演節目。當時我國的兒童教育還是一片荒漠，陳鶴琴留學歸國，就在南京創辦了5所實驗學校和幼稚園，最早在高校開設了兒童心理學課程。
有人在背後議論：“堂堂大學教授，搞娃娃教育有什麽出息？”他卻回應說：“我就是要從小孩教起！”
他更是用自己孩子為模板，進行教育實驗，並歸納總結了科學的兒童觀和教育觀，開創了中國研究兒童的先河。
1925年，他的《兒童心理之研究》出版，這是我國第一本兒童心理學研究專著。另一本《家庭教育》是前書的姊妹書，更是記載了他對兒子一鳴和女兒秀霞進行教育的心得，因而被陶行知評價為“當今中國出版教育專著中最有價值之著作”，此後幾十年中，此書再版了15次。
雖然那時幼稚園開在家中客廳，但他卻胸懷大計劃：建築中國化的幼稚園園舍；改造西洋的玩具使之中國化；創造中國幼稚園的全部活動。1925年，新幼稚園舍落成，他和學生、助手張宗麟等，開始開展幼稚園課程、教材、教學法、設備和兒童習慣培養等實驗。而他們總結、整理的實驗成果，若幹年後成為了我國首部《幼稚園課程暫行標準》的核心內容。
當時我國幼兒教育有三種病：外國病、花錢病、富貴病。陳鶴琴和陶行知等新教育倡導者們甚為感慨，希望能將幼稚園課程從外國模式中解放出來，創造符合兒童特點和國情的課程和教法。1926年2月，他和張宗麟等發表了《我們的主張》一文，其中提出了有關幼稚園教育中適合國情、幼兒心理、教育原理、社會現狀的15條主張，成為了我國現代幼兒園教育的最早綱領。