1532年底，在打敗蘇萊曼一世的進攻後，卡爾五世返回西班牙，準備從那裏開啟對奧斯曼土耳其人的“十字軍東征”（聖戰，Kreuzzug）。戰爭尚未開始，法國國王弗朗索瓦一世便在1534年與柏柏爾人（Barbaresken）和土耳其人結盟，從東西兩向、海陸兩麵向哈布斯堡王朝發起了進攻。羅馬教皇克雷芒七世乘機串通法國，暗中打擊皇帝在意大利的勢力。英國國王亨利八世因為正在與阿拉貢的卡塔琳娜（Catalinade Aragón）鬧離婚，故而轉向了法國一邊。
1535年6月15日，卡爾五世親自統帥軍隊從西班牙出發登陸北非，攻占拉古萊特（La Goletta或La Goulatte）和突尼斯（Tunes或Tunis），取得了轟動全歐洲的勝利。克雷芒七世早在1534年9月25日就去世（大概是被毒死的）了，卡爾五世凱旋羅馬，受到新任教皇保羅三世（Paul III.，1468—1549）的隆重接待。隻是柏柏爾人的勢力並沒有被全部消滅。
1535年11月1日，米蘭公爵弗朗切斯科·斯福紮去世，斯福紮家族絕嗣。卡爾五世將米蘭變為帝國采邑，並將它授予自己的兒子腓力（Felipe，1527—1598）。法國國王弗朗索瓦一世重整軍備，再次進軍意大利，並在1536年4月2日以突然襲擊的方式奪取了薩伏伊和都靈公國。4月17日，卡爾五世親赴梵蒂岡向教皇和樞機主教控訴弗朗索瓦一世屢次毀約的不義之舉，要求與他進行騎士式決鬥。為了迎合樞機主教集團中的改革派，他也提出了通過召開大公會議解決宗教糾紛的主張。但在隨後的普羅旺斯和尼德蘭戰爭中，卡爾五世並沒有取得重大成果。弗朗索瓦一世也未實現修正《康布雷條約》的目標。
卡爾五世固執地堅持從海陸兩麵對土耳其人發動大規模征伐計劃。為此，他在1538年2月8日同教皇和威尼斯結成反土耳其的攻守同盟。但未過多久，威尼斯就單獨與土耳其人媾和，卡爾五世構建的同盟瓦解，其征伐計劃也未付諸實施。6月18日，在教皇保羅三世的調解下，卡爾五世與弗朗索瓦一世在尼斯（Nizza）簽訂了為期10年的停戰協議，規定在意大利維持現狀（Status quo）。弗朗索瓦一世雖然簽署了停戰協議，卻未中斷與土耳其人的勾結。不僅如此，他還積極與神聖羅馬帝國的福音教等級進行聯係，力圖建立廣泛的反哈布斯堡聯盟。