16世紀中葉至17世紀初，神聖羅馬帝國疆域再次發生變動。1552年，帝國諸侯為了對抗皇帝，不惜割讓位於洛林的梅茨、圖爾和凡爾登三個帝國主教區給法國，以爭取法國國王亨利二世的支持。亨利二世遂乘機入侵，並在協助諸侯反叛打敗皇帝後，牢牢地掌握了這三個地區的管轄權。在1559年《卡托—康布雷齊和約》簽訂後，法國雖然放棄了對意大利的領土要求，但繼續占領著梅茨、圖爾和凡爾登以及都靈、薩盧佐和皮涅羅爾等要塞。
更大的疆域變動則是尼德蘭與帝國的分離以及荷蘭的獨立。
尼德蘭位於神聖羅馬帝國西北部，其德文名稱Niederlande的意思是“低窪之地”，泛指萊茵河、繆司河（La Meuse）、些耳德河（Escaut）下遊及北海沿岸一帶地區。這一地區原屬東法蘭克王國版圖，神聖羅馬帝國建立後又成為帝國領土的一部分。自14世紀下半葉，勃艮第公爵接管了尼德蘭。1506年，馬克西米連一世的孫子卡爾，即後來的神聖羅馬帝國皇帝卡爾五世，繼任尼德蘭大公，馬克西米連一世的女兒瑪格麗特擔任攝政，尼德蘭成為哈布斯堡家族的世襲領地。宗教改革時期，尼德蘭，特別是以阿姆斯特丹為首的北部地區接受加爾文教，並成為歐洲各地受迫害的宗教改革者的聚集地。
卡爾五世推行反宗教改革政策，殘酷鎮壓尼德蘭的福音運動，早已激起尼德蘭人民的強烈不滿和堅決反抗。1556年，卡爾五世的兒子、西班牙國王腓力二世接管尼德蘭，尼德蘭成為哈布斯堡家族西班牙支係的世襲領地，與神聖羅馬帝國基本斷絕了關係。1559年，腓力二世整頓尼德蘭教會組織，不僅任命了一批效忠國王的天主教神職人員擔任主教，還委任卡爾五世的私生女、狂熱的天主教徒帕爾瑪的瑪格麗特（Margarethe von Parma，1522—1586）為總督，變本加厲地剝削尼德蘭人，迫害福音教徒。