司馬睿為防止王敦尾大不掉，積極培植自己的勢力，派遣親信戴淵、劉隗等率軍出鎮合肥、淮陰等軍事要地，名義上是防止北方少數民族南下侵犯邊境，實際是為了防範王敦。
太興四年，晉名將周訪、祖逖等先後去世，而大將陶侃遠在南方廣州。
祖逖就是成語“聞雞起舞”的主角，一個忠於晉室的狠角色。當年王敦過於跋扈，祖逖說：阿黑（王敦的小名）這老東西，怎敢這般無禮！再這樣，我就率我家的三千長矛兵打你了！王敦這才收斂了不少。周訪、陶侃兩人是兒女親家，都是戰爭奇才，王敦對他們也頗有忌憚。
如今這些人死的死，散的散，餘子碌碌，不在話下，於是王敦覺得時機到了，終於沒人能治得了自己，便放心大膽地順江而下，準備攻打首都建康，聲稱要殺了皇帝身邊的小人劉隗、刁協。
司馬睿發兵與王敦交戰。
然而這個時候，門閥士族們的態度相當曖昧，不少人認為王敦這麽做是事出有因，其他幾個州的長官也在觀望。就連司馬睿本人也沒有對住在建康城內的王家人下狠手，而是饒恕了王導等王敦的親族。
這個朝廷的抗敵陣線原來是這樣的不統一。
王敦是一流的將帥之才，雙方交戰，司馬睿的部眾連連敗北，王敦一路殺進建康，占領石頭城，控製了整個首都的局勢。司馬睿在皇宮裏成了地地道道的孤家寡人，隻好派出使者與王敦講和，宣告天下說王敦無罪，還封他為武昌郡公。
司馬睿的親信刁協被殺、劉隗逃往北方，王敦一朝權勢在手，豺聲大發，縱兵搶掠建康城，又操縱更換了一批朝臣。
王敦在建康期間自始至終不去朝見司馬睿，即便退回武昌，也依然在遙控朝廷。司馬睿又氣又惱，在憂憤中去世，太子司馬紹繼位，史稱晉明帝。