洪武十五年八月，一代賢後馬氏病逝。不但太祖仰天痛哭，發誓不再立後，就是宮廷內外都默思哀悼。太祖起兵的時候，幾乎每天都要打仗，馬皇後一直跟隨太祖左右，常常勸誡太祖不要大開殺戒。馬氏被冊立為皇後以後，仍然像當初一樣節儉，身上的衣服都洗得褪色了，還不肯換新的。後宮的嬪妃都非常敬重她，將她比作東漢時的明德馬皇後。
皇後生了五個兒子。周王朱橚年紀最小，**不羈。封藩的時候被封到開封，馬皇後派江貴妃和他一起去，還贈給江貴妃一件自己常穿的衣服，一根棍子，對她說：“大王如果有什麽過錯，你就穿上我的衣服，拿著棍子打他。如果他還是倔強的話，馬上報告給我，我決不輕饒！”周王朱橚聽了這話，再也不敢胡作非為了。馬皇後駕崩之後，朱橚又開始放縱。太祖一氣之下將他貶到雲南，後來因為懷念馬皇後的恩德，又把他調了回來。
每次有災荒，馬皇後就帶著後宮的人吃素食，太祖對她說已經發過救濟的糧食了，不必擔憂。馬皇後就說接濟不如預備。馬皇後平時常常會問百姓是不是安居樂業，並說：“皇帝是天下之父，皇後為天下之母，自己的孩子不能安居，父母怎麽能安心呢？”
馬皇後雖然尊貴，但每天仍然親自伺候皇上進餐。皇上早晚的禦膳，她都格外關注。妃嬪們勸她注意自己的身體，馬皇後就對妃嬪們說：“從古到今，做妻子的照顧丈夫的飲食，是理所當然的事情。況且皇上脾氣暴躁，若是偶有失誤，誰敢擔當？”有一次，呈上的湯稍微有些涼，太祖舉起飯碗就扔向馬皇後。馬皇後急忙躲閃，耳畔仍被擦著，受了微傷，更被潑了一身汙漬。馬皇後神態自若，從容地換了衣服，重新呈上熱湯。妃嬪們這才深信馬皇後的話，並折服於馬皇後的德行。宮裏如果有人被臨幸懷了孕，馬皇後就會倍加體恤。妃嬪們如果惹皇上不高興了，馬皇後還會設法調解。