在明朝後期，歐洲天主教耶穌會士紛紛來華，基督教第三次傳入中國，對中國社會尤其是在天文、地理、曆算等實用之學領域產生了一定的影響。
萬曆十年（1582年），意大利籍耶穌會傳教士利瑪竇來華，抵達澳門。隨後他學習中國語言，適應中國傳統習慣，以西洋器物饋贈朝廷地方官員，為入內地傳教鋪平道路。萬曆十一年（1583年），利瑪竇與傳教士羅明堅進入肇慶，築室傳教。萬曆十七年（1589年），利瑪竇遷居韶州，建立首座教堂。萬曆二十三年（1595年），又在南昌建立了第二座教堂，並從此改穿儒服，利用原始儒家思想解釋天主教義，結交士大夫。萬曆二十七年（1599年），他在南京建立了第三座教堂。萬曆二十九年（1601年），利瑪竇終於有機會前往京師入貢方物，明神宗欽賜官職，並敕準長期留居北京。到萬曆三十八年（1610年），利瑪竇病死。而他所領導的中國傳教會已經使兩千多名中國人皈依了基督教。當時在華的還有歐洲神甫13人，澳門出生的中國修士7人。
在明代的兩千多名基督教徒中，很多是上層顯貴和官僚士大夫。據哈克所做的統計，在中國士大夫教徒中，除徐光啟、李之藻、楊廷筠這些重要官員外，“還有一品官14名、進士10人、舉人11人、秀才300人，皇室中還有許多教徒，受洗的人共有140多名。雖然他們在政府中沒有職權，但他們是貴族門第，一定會產生影響。皇帝身邊有40名內侍皈依基督教。這些信徒中，不管是官員還是文人，是王公貴族還是黎民百姓，他們對於自己信奉的宗教是虔誠的。”[63]萬曆年間，耶穌會士在中國建造的教堂有4處，它們分別在北京、南京、南昌和韶關。以上是明代耶穌會士在華傳教的基本成果。他們取得如此傳教成績的原因，一是因為利瑪竇本人博學多識，通過西洋學術打通向內地傳教的道路，采取了適合中國傳統與文化思想的傳教方式；二是得力於明朝一些高級官員與士大夫特別是徐光啟、李之藻和楊廷筠等人的支持和幫助。